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2024年7月山东大学丁兆军教授团队在Advanced Science（IF=14.3）杂志上发表题为“VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis”文章。研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现VIK介导的生长素信号转导分别通过增强LBD18的蛋白质稳定性和诱导ERF13的降解来调节侧根发育。拜谱生物为该研究提供了磷碱化遮盖组学、LC-MS/MS磷碱化位点分析一下技术服务。
英文字母标题文字：VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis（Advanced Science，IF=14.3，2024.07）
繁体中文版头：VIK介导的生长素信号调节拟南芥侧根发育
顾客计量单位：山东大学
探析材质：拟南芥侧根
拜谱带来了技术工艺：磷碱化淡化组学、LC-MS/MS磷碱化位点概述
分析难点：
PART 01 探析最终结果
01、衍生素提高VIK的磷硝化作用试述转录
为了鉴定生长素触发的潜在磷酸化调控因子，作者对10日龄拟南芥幼苗根用10 µM 萘乙酸（NAA）处理15分钟和8小时后进行磷酸性反应淀粉酶质类物质析，结果发现VIK可能通过磷酸化修饰在介导生长素信号传递中发挥关键作用（图1A）。
图1 生长的素有利于促进VIK的磷过酸简答转录
为了验证上述结果，作者在大肠杆菌中表达了带有6个组氨酸标签的重组VIK蛋白（His-VIK），并在细胞自由蛋白系统中进行了磷碱化实验所。发现His-VIK随着时间的推移磷酸化水平略有增加。在野生型拟南芥幼苗的根组织裂解液中，NAA处理15分钟和30分钟后，His-VIK的磷酸化水平显著增加，表明生长素能显著促进VIK的磷酸化（图1B）。
通过酵母菌双混种杂交深入分析（Y2H）和烟草叶片中的荧光素酶互补原理成相科学实验（LCI）证实了VIK与TMK1之间存在直接相互作用，并且身体之外磷硝化作用实验表明TMK1可以磷酸化VIK。通过生成ProVIK:VIK-GFP转基因系进行的蛋白降解实验显示生长素可能不影响VIK蛋白的稳定性（图1C）。实时公交参考值PCR分析发现，生长素处理能时间依赖性地诱导VIK转录水平的增加（图1D），且这种诱导主要通过ARF7/19依赖性方式实现，在arf7/19突变体中VIK表达的诱导明显减弱，而在lbd16/18/33突变体中VIK表达仍能被生长素显著诱导。
02、VIK 介导的叶绿素走势主动性管控 LR 健康
使用研究分析两大VIK T-DNA加上变异体（vik-2和vik-3），知道与原生态型优于，变异体的LR溶解度、LR原基（LRP）和已出现的LR可观增多，还是比较是vik-2（图2）。相反的词语，过呈现VIK的转染色体植物遗传根系行为 出LR溶解度添加。最后，在vik-2变异体背景图下呈现VIK的转染色体植物遗传根系灰复了LR出现瑕疵。出现素净化处理实验报告发现，vik-2变异体对出现素诱导性的LR出现化学反应减低，发现VIK在出现素改善LR出现中推动重要效用。 
图2 VIK介导的成长素表现径路正向着宏观调控LR的胸部发育
03、VIK 与ERF13 参与生物学相互
研究发现VIK在生长素诱导的侧根（LR）发育中扮演关键角色，因此推测ERF13可能是VIK的潜在底物。通过Y2H、LCI、双氧分子荧光互替 （BiFC）和天然免疫共滤渣实验性（CO-IP），证实了VIK与ERF13之间存在直接的相互作用（图3）。这些结果表明VIK与ERF13在物理上相互作用，支持了ERF13可能是VIK作用底物的假设。
图3 VIK与ERF13主动帮助
04、VIK以正负极馈的措施管控ERF13磷碱化
通过磷过酸核蛋白组学解析，发现NAA处理可快速诱导ERF13磷酸化。体外实验表明，VIK具有自磷酸化活性，并可直接磷酸化ERF13的Ser168和Ser172位点（图4）。点基因变异出现显著降低了ERF13的磷酸化水平。此外，ERF13可增强VIK的自磷酸化，尤其是ERF13的磷酸模拟突变体。进一步实验表明，VIK可通过形成同源二聚体进行自磷酸化，但ERF13突变体不影响VIK二聚体的形成。总体而言，VIK通过反馈机制调控ERF13的磷酸化。
图4 VIK以正反面馈模式磷过酸ERF13的Ser168和Ser172位点
05、VIK介导的磷过酸使得ERF13挥发
研究发现，VIK介导的磷酸化作用影响ERF13蛋白的稳定性，进而调控侧根发育。实验显示，ERF13蛋白在早期侧根原基中表达，随后在发育过程中消失，而VIK蛋白在所有侧根中持续表达（图5）。通过休外测试和内测试，发现VIK能够促进ERF13的降解。进一步通过磷酸仿真模拟和磷酸灭活变异体的实验，证实了ERF13在Ser168和Ser172位点的磷酸化促进了其降解。此外，VIK与MPK14可能协同作用促进ERF13降解，但两者之间没有直接的相互作用。最后亚细胞膜市场定位进行分析表明，ERF132D和ERF132A均位于细胞核，且与WT无明显差异。qRT-PCR结果显示，vik-2突变体中ERF13 mRNA水平未显著变化，但其下游基因KCS8和KCS16显著降低，进一步证明VIK在蛋白水平上调控ERF13。总之，VIK介导的磷酸化通过负调控ERF13的稳定性，加速生长素诱导的ERF13降解。
图5 VIK 介导的磷硝化作用t加速了ERF13吸附
06、VIK 介导的 ERF13 磷碱化控制 LR 的显示
研发进步研究方案了VIK干预的ERF13生物降解塑料在侧根（LR）胸部发育中的效应。凭借比效各个转什么是基因花草系的LR表型，得知过把你想理解出来出来ERF13减缓了LR的冒出，在vik基因突变体中等等减缓效应增进，而在过把你想理解出来出来YFP-VIK的后台下等等减缓效应衰弱（图6）。不仅而且，比效ERF13的各个磷过酸摸拟和磷酸降解塑料突变体的过把你想理解出来出来花草系，得知ERF132A-Myc（磷酸降解塑料）的花草系LR冒出少点，而ERF132D-Myc（磷过酸摸拟）的花草系LR冒出略多。等等报告得出结论，VIK介导的ERF13磷过酸和生物降解塑料增强了LR的冒出。 
图6 VIK介导的ERF13磷酸性反应增进LR的出现了
07、VIK在侧根胸部发育中磷碱化并安全LBD18核蛋白
顺利通过解析好几个VIK T-DNA添加变化体（vik-2和vik-3），发掘与野生穿山甲型相对，变化体的侧根（LR）孔隙率、LR原基（LRP）和已成长的LR偏态才能减少，尤为是vik-2（图7）。反之，过抒发VIK的转DNA茎秆表現出LR孔隙率增高。显然，在vik-2变化体的背景下抒发VIK的转DNA茎秆康复了LR成长不足。植物产生期素解决检测表示，vik-2变化体对植物产生期素分析的LR成长反应迟钝减小，表示VIK在植物产生期素干预LR成长中树立关键的帮助。 
图7 VIK 在LR成型整个过程中简单磷硝化作用和不稳LBD18球蛋白
PART 02 新闻稿件总结ppt
生长素作为最重要的植物激素之一，在调控植物生长和发育过程中起着关键作用。这项研究通过磷硝化作用核高蛋白组学分享筛选到快速响应生长素的蛋白激酶VIK，并证实VIK通过调控LBD18和ERF13来调控侧根的形成。一方面，生长素以ARF7/19依赖的方式诱导VIK的转录；另一方面，它通过TMK1激活VIK的激酶活性，激活的VIK可以磷酸化LBD18和ERF13。磷酸化的LBD18变得更加稳定，调节侧根的启动。然而，磷酸化的ERF13经历降解，缓解了其对侧根出现的抑制，从而促进侧根的形成（图8）。VIK的发现不仅丰富了我们对生长素信号传递机制的理解，而且为农业生产中通过调控生长素信号来提高作物产量和抗逆性提供了潜在的策略。
图8 VIK介导的发育素数据信息调整侧根形成了
PART 03 拜谱个人总结
研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现 VIK 介导的生长素信号转导分别通过增强 LBD18 的蛋白质稳定性和诱导 ERF13 的降解来调节 LR 发育。拜谱生物作为一家国内领先的多组学服务公司，可提供完善成熟的球蛋清质含量组学、淡化球蛋清质含量组学、排泄组学、转录组学等多组学产品技术服务体系。拜谱特色磷酸化修饰产品—高水准高度DIA·磷酸性反应掩盖组，采用创新丰度技艺+Astral DIA，超高深度赋能低丰度磷酸化蛋白/位点发掘，单针最高可实现小动物样表10w+、常绿植物样表5w+磷酸化修饰位点检出，可广泛应用于植物、动物研究，绘制物种磷酸化修饰图谱，助力高分文章发表。此外，磷酸化修饰组学可与蛋白组学、代谢组学等多组学联合，整合多组学数据进行深入挖掘分析，全面解析机制机理等。欢迎咨询！
参考选取文章：
Shang E, Wei K, Lv B, Zhang X, Lin X, Ding Z, Leng J, Tian H, Ding Z. VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 3:e2402442. doi: 10.1002/advs.202402442. Epub ahead of print. PMID: 38958531.
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